[[Berkas:Kamus_Bahasa_Melayu_Ambon-Indonesia.png|al=|jmpl|227x227px|KamusTemplat:Pranala mati bahasa Ambon–Indonesia.]]

Bahasa utama yang dituturkan oleh suku Ambon adalah bahasa Ambon atau Melayu Ambon, salah satu bahasa rumpun Austronesia yang sejatinya merupakan dialek Melayu hasil perkembangan bahasa tanah (asli) yang dipengaruhi kuat oleh bahasa Melayu.[61] Menurut pengelompokan bahasa Maluku, bahasa Ambon termasuk dalam kelompok bahasa Siwalima.[1] Penggunaan bahasa Ambon yang merupakan dialek bahasa Melayu oleh suku Ambon dilatarbelakangi oleh perdagangan dan penjajahan. Kini, bahasa Ambon tak hanya digunakan oleh suku Ambon, tetapi juga digunakan sebagai basantara seluruh Maluku di samping bahasa Indonesia.[70]

Bahasa Ambon terpengaruh kuat oleh bahasa Portugis, dapat dilihat dari banyaknya kosakata Portugis yang terserap. Meskipun penjajahan Belanda berlangsung lebih lama, jumlah kosakata serapan bahasa Portugis berbanding lebih besar, jika dibandingkan dengan jumlah kosakata serapan bahasa Belanda. Hal ini disebabkan bangsa Portugis merupakan orang Eropa pertama yang menguasai Maluku sehingga merekalah yang memperkenalkan berbagai barang, cara, gagasan, dan budaya Eropa kepada suku Ambon. Selain itu, macam bunyi dalam bahasa Portugis tidak begitu asing di telinga suku Ambon, bila dibandingkan dengan bahasa Belanda. Bunyi tajam dan adanya suara tenggorokan dianggap menyulitkan orang Ambon dalam melafalkan bahasa Belanda sampai sekarang.[71]

Sementara itu, bahasa tanah yang dituturkan oleh suku Ambon adalah bahasa Asilulu. Saat ini dalam lingkup wilayah budaya Ambon, bahasa Asilulu terbagi menjadi lima belas dialek: lima di Ambon, satu di Haruku, satu di Saparua, satu di Nusalaut, dan tujuh di Seram. Menurut penelitian terbaru, masing-masing dialek memiliki perbedaan dengan kisaran 52 hingga 77 persen.[72]

Setelah Perusahaan Hindia Timur menaklukkan seluruh Kepulauan Ambon-Lease, gereja-gereja dan sekolah-sekolah yang dibangun di kawasan tersebut menggunakan bahasa Melayu sebagai bahasa pengantarnya dan aksara Latin sebagai aksara menulisnya.[73] Keputusan menggunakan bahasa Melayu ini telah melalui langkah panjang yang memberikan tiga pilihan: bahasa Belanda, bahasa Melayu, atau bahasa tanah. Setelah Belanda gagal menerapkan bahasa Belanda, bahasa Melayu dipilih karena bahasa tanah terlalu sulit dipelajari, bahasa Melayu dapat digunakan di mana-mana, dan keadaan pada masa itu ketika suku Ambon menganggap rendah bahasa tanahnya bila dibandingkan dengan bahasa Melayu.[74] Alkitab terjemahan ke dalam bahasa Melayu tinggi oleh Melchior Leijdecker pun mulai diterbitkan pada 1773, disusul oleh terjemahan François Valentijn ke dalam bahasa Melayu yang digunakan di Ambon sehari-hari yang tidak pernah diterbitkan.[75] Alkitab terjemahan Leijdecker dan keterpencilan Maluku Tengah inilah yang mendorong pembakuan bahasa Melayu setempat, yakni bahasa Ambon untuk pertama kalinya.[76] Pada masa selanjutnya hingga kemerdekaan, bahasa Ambon ditulis oleh aksara Latin dan abjad Arab. Aksara Latin digunakan oleh negeri-negeri Kristen, sedangkan abjad Arab digunakan oleh negeri-negeri Islam.[77] Bahasa tanah sebagai bahasa ibu pun perlahan-lahan digantikan kedudukannya oleh bahasa Ambon.[74]